在《海贼王》动画中，草帽一伙共有两次重大“分开”剧情，需要看你指的是哪一次：

1. 香波地群岛分开（第一次真正意义上的全员分散）
   动画从第394集开始进入香波地群岛篇，路飞等人遭遇海军大将黄猿和巴索罗米·熊。
   真正被熊拍飞、全员分散是在第405集左右（具体为第405话「被夺走的伙伴们」附近）。
   所以通常说“草帽一伙从第405集左右开始分开”。

2. 司法岛篇乌索普离队（局部离队）
   更早还有乌索普因梅利号事件离队，大约在第236集左右，但这不是全员分开。

如果你问的是“路飞和伙伴们全员分开两年修炼”的那次，答案就是：动画第405集左右（香波地群岛篇末尾）。